Flow chart of a PCR-based cloning project

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Experimenteller Ablaufplan eines klassischen PCR-basierten Klonierungsprojekts

(LIC-basiertes Klonieren kann in vergleichbarer Zeit mit ähnlichen Schritten durchgeführt werden)

Montag

• PCR (5 × 50 µl Reaktionen im Temperaturgradienten)
• 5 µl jeder PCR-Reaktion auf Agarosegel laden, Produktgröße & Qualität kontrollieren
• 2–3 Proben kombinieren (3 × 45 µl), 5 µl DpnI hinzufügen, 1 h bei 37 °C inkubieren
• 5-faches Volumen Puffer PB (750 µl) zugeben, Fragmente mit PCR-Purification-Kit auf 1 Säule reinigen
• In 45 µl Wasser eluieren
• 5 µl 10× Restriktionspuffer zugeben, Enzym(e) (~5 U) hinzufügen
• In parallelem Ansatz: Zielvektor mit gleichen Enzymen verdauen, Kontrollen nicht vergessen (Einzelenzym / kein Enzym)
• Verdau 5 h bis über Nacht bei 37 °C

Dienstag

• Verdauprodukte (PCR-Produkt, Vektor, Kontrollen) auf Präparationsgel laden
• Gel bei 40 V laufen lassen, anfärben/entfärben, Bild machen
• Banden des geschnittenen PCR-Produkts & Vektors ausschneiden, mit Gel-Extraktionskit reinigen
• In 40 µl EB-Puffer eluieren
• 5 µl gereinigte Produkte erneut auf Gel laden, Qualität & Quantität überprüfen
• Ligation aufsetzen (Insert:Vektor = ca. 5:1) in 10 µl Gesamtvolumen
• Kontrollligation nur mit Vektor
• Über Nacht ligieren bei 4 °C

Mittwoch

• 10 µl Ligationsansätze in ultrakompetente E. coli NovaBlue transfizieren
• Auf geeigneten Antibiotika-haltigen LB-Platten ausplattieren

Donnerstag

• Klone von den Platten picken (wenn Kontrolle keine oder wenige Kolonien zeigt)
• „Cake-style“ auf frische Platten streichen

Freitag

• Plasmid-Minipreps von 10–20 Klonen
• Größenvergleich auf Agarosegel mit Zielvektor, Template-Vektor und positivem Kontrollplasmid
• Kontrollverdau mit 2–3 vielversprechenden Plasmiden
• Sequenzierung eines positiven Klons

YOU ARE ALMOST DONE! 🎉

Vorgehen, Dokumentation und Datenhaltung bei gentechnischer Arbeit

Titel des Projekts

• (Name des Plasmids / Inserts, z. B. „pXYZ-GFP-tagged-PAK1“)

Zielstellung

• Kurze Beschreibung der Zielsetzung (z. B. Expression eines Proteins in HEK293T-Zellen)

Materialangaben

• verwendeter Vektor
• Insert (Quelle, Amplifikation)
• verwendete Enzyme (inkl. Anbieter, Katalognummern)
• Zelllinie für spätere Verwendung

Experimentelle Schritte (mit Datum)

1. PCR und Aufreinigung
2. Restriktionsverdau von Insert und Vektor
3. Gel-Extraktion
4. Ligation
5. Transformation
6. Auswahl positiver Klone
7. Minipreps und analytische Kontrolle (z. B. durch Restriktionsverdau oder PCR)
8. Sequenzierung

Ergebnisse & Bewertung

• Agarosegelbilder als Screenshot oder Ausdruck mit Legende
• Sequenzierungsergebnisse als PDF oder Link zur Datei
• Kommentar zur Qualität der Klone

Aufbewahrung der DNA

• Plasmidpräps: Standort, Datum, Konzentration
• Glycerinstocks: Lagerort (z. B. -80 °C Freezer), Beschriftung

Hinweise zur Dokumentation

• Alle Schritte müssen mit Datum dokumentiert werden
• Wiederholungen sind klar zu kennzeichnen
• Abweichungen vom Protokoll kommentieren