Vorlage Klonierungsprojekt

Vorlage für Klonierungsprojekte

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Hinweis: Alle Datumsangaben, Enzyme, Vektoren etc. bitte entsprechend aktualisieren.

Projekttitel

(z. B. Klonierung von GFP-tagged PAK1 in pcDNA3.1)

• Startdatum: __.__.20__
• Bearbeiter: Benutzer:DeinName

Zielstellung

Kurze Beschreibung, was mit dieser Klonierung erreicht werden soll.

• z. B.: Herstellung eines Expressionsvektors für transfizierbare GFP-PAK1-Konstrukte in HEK293T-Zellen.

Genutzte Materialien

• **Vektor**: Name, Herkunft, Kartennummer
• **Insert**: Quelle (z. B. cDNA, PCR), Primer
• **Enzyme**: Name, Anbieter, Katalognummer
• **Bakterienstamm**: z. B. E. coli NovaBlue
• **Zelllinie für spätere Transfektion**: (falls relevant)

Experimenteller Ablauf

Tag 1 – PCR & DpnI-Verdau

1. PCR mit Insert-Template
2. Kontrolle auf Agarosegel
3. DpnI-Verdau (1 h, 37 °C)
4. Reinigung mit PCR-Cleanup Kit

Tag 2 – Restriktion & Gel-Extraktion

1. Restriktionsverdau Insert & Vektor
2. Kontrollansätze: Vektor-only, no enzyme
3. Agarosegel & Bild
4. Banden ausschneiden, Gelreinigung

Tag 3 – Ligation & Transformation

1. Insert + Vektor ligieren (~5:1), o/n bei 4 °C
2. Transformation in NovaBlue
3. Ausplattieren auf selektiven Medien

Tag 4 – Klon-Selektion & Miniprep

1. Kolonien picken, „Cake-style“ streaking
2. Miniprep aus 10–20 Klonen
3. Größenkontrolle auf Gel, ggf. Restriktionskontrolle

Tag 5 – Sequenzierung

1. Auswahl positiver Klone
2. Sequenzierung beauftragen (Dateiname, Anbieter)

Ergebnisse

Agarose-Gelbilder

• Gel 1 (PCR)
• Gel 2 (Verdau)
• Gel 3 (Miniprep)

Sequenzanalyse

• Ergebnisdateien (z. B. PDF-Link, Screenshot)
• Kommentar: Sequenz korrekt? Leserahmen, Mutation?

Plasmidlagerung

• Minipreps: Datum, Konzentration, Lagerort
• Glycerinstocks: ID, -80 °C Freezer-Box, Etikettierung

Kommentare / Probleme

z. B. geringe Klonausbeute, unerwartete Bandengröße, neue Primer nötig etc. Klonierungsprojekt