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	== Experimenteller Ablaufplan eines klassischen PCR-basierten Klonierungsprojekts ==		== Experimenteller Ablaufplan eines klassischen PCR-basierten Klonierungsprojekts ==

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== Experimenteller Ablaufplan eines klassischen PCR-basierten Klonierungsprojekts ==

''(LIC-basiertes Klonieren kann in vergleichbarer Zeit mit ähnlichen Schritten durchgeführt werden)''

=== Montag ===
* PCR (5 × 50 µl Reaktionen im Temperaturgradienten)
* 5 µl jeder PCR-Reaktion auf Agarosegel laden, Produktgröße & Qualität kontrollieren
* 2–3 Proben kombinieren (3 × 45 µl), 5 µl DpnI hinzufügen, 1 h bei 37 °C inkubieren
* 5-faches Volumen Puffer PB (750 µl) zugeben, Fragmente mit PCR-Purification-Kit auf 1 Säule reinigen
* In 45 µl Wasser eluieren
* 5 µl 10× Restriktionspuffer zugeben, Enzym(e) (~5 U) hinzufügen
* In parallelem Ansatz: Zielvektor mit gleichen Enzymen verdauen, Kontrollen nicht vergessen (Einzelenzym / kein Enzym)
* Verdau 5 h bis über Nacht bei 37 °C

=== Dienstag ===
* Verdauprodukte (PCR-Produkt, Vektor, Kontrollen) auf Präparationsgel laden
* Gel bei 40 V laufen lassen, anfärben/entfärben, Bild machen
* Banden des geschnittenen PCR-Produkts & Vektors ausschneiden, mit Gel-Extraktionskit reinigen
* In 40 µl EB-Puffer eluieren
* 5 µl gereinigte Produkte erneut auf Gel laden, Qualität & Quantität überprüfen
* Ligation aufsetzen (Insert:Vektor = ca. 5:1) in 10 µl Gesamtvolumen
* Kontrollligation nur mit Vektor
* Über Nacht ligieren bei 4 °C

=== Mittwoch ===
* 10 µl Ligationsansätze in ultrakompetente ''E. coli'' NovaBlue transfizieren
* Auf geeigneten Antibiotika-haltigen LB-Platten ausplattieren

=== Donnerstag ===
* Klone von den Platten picken (wenn Kontrolle keine oder wenige Kolonien zeigt)
* „Cake-style“ auf frische Platten streichen

=== Freitag ===
* Plasmid-Minipreps von 10–20 Klonen
* Größenvergleich auf Agarosegel mit Zielvektor, Template-Vektor und positivem Kontrollplasmid
* Kontrollverdau mit 2–3 vielversprechenden Plasmiden
* Sequenzierung eines positiven Klons

'''YOU ARE ALMOST DONE! 🎉'''

== Vorgehen, Dokumentation und Datenhaltung bei gentechnischer Arbeit ==

=== Titel des Projekts ===
* (Name des Plasmids / Inserts, z. B. „pXYZ-GFP-tagged-PAK1“)

=== Zielstellung ===
* Kurze Beschreibung der Zielsetzung (z. B. Expression eines Proteins in HEK293T-Zellen)

=== Materialangaben ===
* verwendeter Vektor
* Insert (Quelle, Amplifikation)
* verwendete Enzyme (inkl. Anbieter, Katalognummern)
* Zelllinie für spätere Verwendung

=== Experimentelle Schritte (mit Datum) ===
# PCR und Aufreinigung
# Restriktionsverdau von Insert und Vektor
# Gel-Extraktion
# Ligation
# Transformation
# Auswahl positiver Klone
# Minipreps und analytische Kontrolle (z. B. durch Restriktionsverdau oder PCR)
# Sequenzierung

=== Ergebnisse & Bewertung ===
* Agarosegelbilder als Screenshot oder Ausdruck mit Legende
* Sequenzierungsergebnisse als PDF oder Link zur Datei
* Kommentar zur Qualität der Klone

=== Aufbewahrung der DNA ===
* Plasmidpräps: Standort, Datum, Konzentration
* Glycerinstocks: Lagerort (z. B. -80 °C Freezer), Beschriftung

=== Hinweise zur Dokumentation ===
* Alle Schritte müssen mit Datum dokumentiert werden
* Wiederholungen sind klar zu kennzeichnen
* Abweichungen vom Protokoll kommentieren

Flow chart of a PCR-based cloning project - Revision history

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